Pseudomonas aeruginosa (pao1) suşunun değişik ısı ve değişik üreme fazlarında housekeeping gen ekspresyon düzeyleri

Abstract

P. aeruginosa PA01 standart kökeninin ve dört ayrı hastaneden elde edilmiş dört P. aeruginosa klinik kökeninin 8 housekeeping geni 37 ve 42 derecelerde Brain-Heart Infusion, Mueller-Hinton ve Tryptic Soy Broth sıvı besi yerlerinde ve ayrıca dört değişik NaCl yoğunluğunda mRNA anlatımları açısından gerçek zamanlı PZR deneyi ile ölçüldü. Amaç değişen koşullara karşın anlatımı en istikrarlı genleri seçmek ve mRNA anlatımları açısından bağıl nicelik kıyaslaması yapmayı hedefleyen gelecek çalışmalarda bu istikrarlı genlerin gerçek zamanlı PZR deneylerinde iç kontrol olarak kullanımını önermektir. Bu amaçla PA01 genomundan Oligo 5.0 programı yardımı ile proC, fabD, rpoD, rpoS, oprB, rodA, rpoB ve fonksiyonu bilinmeyen gen x1 seçilerek bunları hedef alan primer dizileri belirlendi. Total RNA izolasyonu asit-fenol guanidine metodu ile izole edilip Random Hexamer Primerleri aracılığı ile cDNA ya çevrildi. Deneyler 570C derece annealing ısısı kullanılarak ve SYBR Gren I boyasının ışıma miktarları 840C da ölçülerek yapıldı. Deneylerde elde edilen "Crossing Point" değerleri Bestkeeper ve NCSS programları aracılığı ile istikrarlılık ve birbirleri ile uyum açısından değerlendirildi. proC ve rpoD genleri hem PA01 standart köken için hem de dört klinik izolat için en istikrarlı ve birbirleri ile uyumlu genler olarak bulundu. Bu genlerin P. aeruginosa ile yapılacak bağıl nicel kıyaslama amaçlayan gerçek zamanlı PZR deneylerinde iç kontrol olarak kullanılmaları önerildi.

Expression stability of 8 Housekeeping genes of P. aeruginosa PA01 and of four other clinical strains of P. aeruginosa isolated in four different hospitals were studied with real time PCR methodology after incubating these strains in 37 and 42 degrees centigrade in Brain-Heart Infusion, Mueller-Hinton and Tryptic Soy broth media and additionally in broth media with different NaCl concentrations. This study aimed to find most stable genes to be used in future studies as internal controls for relative quantification of mRNA expressions of genes in P. aeruginosa. For this purpose, primers were designed by the aid of Oligo 5.0 for proC, fabD, rpoD, rpoS, oprB, rodA, rpoB and an unknown porin like gene x1 of the genome of PA01. Total RNA from strains was isolated by the acid-phenol guanidine method and transcribed to cDNA by Random Hexamer Primers. PCR cycles were accomplished by an annealing temperature of 570C and the readings for SYBR Green I dye were at 840C. Crossing points were evaluated for stability and correlation to each other by the softwares Bestkeeper and NCSS. Both in PA01 and in clinical strains proC and rpoD genes were the most stable genes. This study suggested using these genes as the internal control of relative quantifications of genes in P. aeruginosa by real-time PCR method.