Nörotoksin analizi için immünassay geliştirilmesi

Abstract

Amaç: Anaerobik sporlu bir bakteri olan Clostridium botulinum tarafından üretilen Botulinum nörotoksini (BoNT) doğada bilinen en potent toksindir. Moleküler ağırlığı 150 kDa olan toksin, proteinin tersiyer yapısında meydana gelen iki aşamalı modifikasyon ile iki zincirli hale gelir. Bu haliyle sinir hücrelerine endositoz yoluyla giren toksin sinaptozomal ilişkili protein 2 (SNAP-25) ve sinaptobrevin-2 gibi sinaptik proteinleri keserek nöromusküler kavşaktaki nörotransmiter salınımını engeller ve kasların kasılıp paralize olması ile sonuçlanan botulizm adlı ölümcül hastalığa neden olur. Aynı zamanda Hastalık Kontrol ve Korunma Merkezleri (CDC) tarafından A sınıfı biyolojik ajan listesinde bulunan BoNT’un biyoterörizm amaçlı kullanım potansiyelinin de yüksek olması toksinin hızlı tespitinin yapılmasının önemini artırmaktadır. Toksinin saptanmasında altın standart fare biyoanalizi olarak kabul edilmekle birlikte birçok deney hayvanının kullanılmasına sebep olması, yoğun emek gerektirmesi ve zaman alıcı (4 güne kadar) olması sebebiyle yeterince pratik bulunmamaktadır. En önemlisi, fare biyoanalizi yapılırken botulizm şüphesi ile tedavi altında olan hastaların toksinin çok hızlı etki etmesi sebebiyle kaybedilme olasılıkları yüksektir, dolayısıyla BoNT tespiti için hızlı ve yüksek duyarlığa sahip tanı sistemlerinin geliştirilmesi gerekmektedir. Söz konusu tez kapsamında, BoNT A’nın hızlı tespiti için yüksek duyarlıklı antikorların geliştirilerek ELİSA tabanlı bir sistemde kullanımı amaçlanmıştır. Yöntem: BoNT A'nın hafif zincirine (LC) ve ağır zincirde bulunan reseptör bağlanma bölgesi (HC) ile translokasyon bölgelerine (HN) özgü sentetik epitopik bölgeler, IEDB'den B hücresi "Epitop Tahmin Araçları" kullanılarak antijen olarak seçildi ve bir yazılımla (Discovery Studio 4.0) BoNT A yüzeyinde olduğu gösterildi. Seçilen peptitler, fare bağışıklamalarında kullanıldı ve geliştirilen anti-peptit antikorları ile doğal yapılı BoNT A arasındaki ilişki incelendi. Bulgular: Farelerde üç farklı peptide (P1, P2 ve P3) karşı geliştirilen anti-peptit antikorları ile mililitrede pikogram seviyelerinde doğal yapılı BoNT A'nın saptanması gerçekleştirildi. Sonuç: Bu çalışma, sentetik peptitlerin, toksinlere karşı yüksek afiniteli antikorları geliştirmek için en az doğal toksin veya toksoidin kendisi kadar etkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca botulizmin hızlı teşhisine duyulan ihtiyaç ve halihazırda kullanılan test sistemlerinde çok sayıda deney hayvanının kurban edildiği göz önüne alındığında, bu sonuçlar benzer çalışmalarda hem hayvan sayısını hem de toksin kullanım miktarını azaltmak için sentetik peptit immünojenlerinin kullanılmasının gerekliliğini ortaya koymaktadır. Bu çalışma TÜBİTAK tarafından 117H001 no’lu “1009 Tavşan Serumu Projesi” kapsamında desteklenmiştir.

Objective: Botulinum neurotoxin (BoNT), produced by Clostridium botulinum, an anaerobic spore-forming bacterium, is the most potent toxin known in nature. The toxin, with a molecular weight of 150 kDa, becomes two-chain with a two-step modification that occurs in the tertiary structure of the protein. In this state, the toxin, which enters the nerve cells through endocytosis, cuts synaptic proteins such as synaptosomal-associated protein 2 (SNAP-25) and synaptobrevin-2, inhibits neurotransmitter release at the neuromuscular junction and causes the fatal disease called botulism, which results in muscle contraction and paralysis. At the same time, the high potential for bioterrorism use of BoNT, which is on the Class A biological agent list by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), increases the importance of rapid detection of the toxin. Although it is accepted as the gold standard, mouse bioanalysis for toxin detection, it is not practical enough because it causes the use of many experimental animals, requires intensive labor and is time consuming (up to 4 days). Most importantly, while performing mouse bioanalysis, patients under treatment for suspected botulism are likely to die due to the rapid action of the toxin, so rapid and high-sensitivity diagnostic systems for BoNT detection need to be developed. Within the scope of the thesis, it is aimed to develop high-sensitivity antibodies for rapid detection of BoNT A and use them in an ELISA-based system. Methods: Synthetic epitopic regions specific to the light chain (LC) of BoNT A and the receptor binding site (HC) and translocation sites (HN) found in the heavy chain were selected as antigens using B cell "Epitope Prediction Tools" from IEDB and analyzed with a software ( Discovery Studio 4.0) was shown to be on the BoNT A surface. Selected peptides were used in mouse immunizations and the relationship between the developed anti-peptide antibodies and native BoNT A was examined. Results: With anti-peptide antibodies developed against three different peptides (P1, P2 and P3) in mice, natural BoNT A was detected at picogram levels per milliliter. Conclusion: This study shows that synthetic peptides are at least as effective as the natural toxin or the toxoid itself in promoting high-affinity antibodies against toxins. In addition, given the need for rapid diagnosis of botulism and the large number of experimental animals sacrificed in currently used test systems, these results demonstrate the necessity of using synthetic peptide immunogens to reduce both the number of animals and the amount of toxin use in similar studies. This study was supported by TUBITAK within the scope of "1009 Rabbit Serum Project" numbered 117H001.